前言
含有相同藥物活性成份的兩種制劑，若在相同摩爾劑量給后的生物利用度（藥物吸收速度和吸收程度）落在可接受的預(yù)定限度內(nèi)，則被認為具有生物等效性。生物等效性分類（BCS）是一種根據(jù)溶解性和滲透性對藥物進行分類的方法，分為4個類別，即Ⅰ類（高溶解性，高滲透性）、Ⅱ類（低溶解性，高滲透性）、Ⅲ類（高溶解性，低滲透性）、Ⅳ類（低溶解性，低滲透性）。基于BCS的基本理論，藥物活性成分（API）與藥物制劑的溶出特征和輔料組成，二者一同構(gòu)成控制普通口服制劑API吸收率和吸收程度的主要因素。
1.
基于BCS分類豁免生物等效性的發(fā)展
FDA于2000年發(fā)布指導(dǎo)原則，允許BCS Ⅰ類API的普通口服固體制劑在特定的溶出特征和輔料組成條件下豁免生物等效性研究，是首個應(yīng)用BCS的生物等效性豁免的監(jiān)管機構(gòu)。NMPA于2016年發(fā)布了《人體生物等效性豁免指導(dǎo)原則》，適用于仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價中普通口服制劑基于BCS申請生物等效豁免，并于2018年多次單獨發(fā)布可豁免或簡化人體生物等效性試驗品種目錄。2019年ICH指導(dǎo)原則《M9：基于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的生物等效性豁免》進入Step 4采納階段，目前在實施階段。我國國家藥監(jiān)局藥審中心于2021年12月發(fā)布第61號公告《關(guān)于實施國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會指導(dǎo)原則M9及問答有關(guān)事項的通知》，標志著我國基于BCS分類系統(tǒng)生物等效性豁免全面執(zhí)行ICH M9指導(dǎo)原則。
2. Caco-2
細胞在基于BCS分類豁免生物等效性中的應(yīng)用
Caco-2
細胞模型是一種人克隆
結(jié)腸腺癌細胞，其結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸
上皮細胞，具有
微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸
刷狀緣上皮相關(guān)的
酶系，可以用來進行模擬體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運的實驗。ICH M9指導(dǎo)原則指出，評價滲透性應(yīng)優(yōu)先基于人體藥代動力學(xué)研究得出的吸收程度，例如絕對生物利用度或物質(zhì)平衡。若絕對生物利用度³85%，則認為具有高滲透性。若³85%的給藥劑量在尿中以原形藥物，或以原形藥物、Ⅰ相氧化和Ⅱ相結(jié)合代謝產(chǎn)物的總回收率，也認為具有高滲透性。基于BCS分類豁免生物等效性可接受已發(fā)表文獻中的人體數(shù)據(jù)，但需包含必要的試驗細節(jié)，否則無法判斷研究結(jié)果的質(zhì)量。還可使用經(jīng)驗證和標準化的Caco-2細胞體外方法評價滲透性，但Caco-2細胞測定結(jié)果應(yīng)基于已獲得的人體藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)進行評價。若通過體外細胞模型推斷為高滲透性，還需證明滲透性不依賴于主動轉(zhuǎn)運。
圖1 Transwell培養(yǎng)板建立Caco-2細胞模型
3. Caco-2
細胞滲透性測定方法的相關(guān)考慮
方法學(xué)驗證
應(yīng)使用零、低（<50%）、中（50-84%）和高（³85%）滲透模型藥物，建立實驗滲透率與人體藥物吸收程度之間的排序相關(guān)性，以證明Caco-2細胞測定方法用于BCS滲透性測定的適用性。應(yīng)通過在試驗前后比較跨上皮電阻（TEER）測量值和或其他合適指標，確認Caco-2細胞單層的完整性。還應(yīng)通過已證實的零滲透性化合物證明細胞單層的完整性（參見表1）。
表1 用于滲透性測定方法驗證模型藥物示例
|
分組 |
藥物 |
高滲透性
（fa³85%） |
安替比林、***、酮洛芬、萘普生、茶堿、美托洛爾、普萘洛爾、卡馬西平、苯妥英、丙吡胺、米諾地爾 |
中滲透性
（fa =50-84%） |
氯苯那敏、肌酐、特布他林、氫氯噻嗪、依那普利、呋塞米、二甲雙胍、阿米洛利、阿替洛爾、雷尼替丁 |
中滲透性
（fa <50%） |
法莫替丁、納多洛爾、舒必利、賴諾普利、阿昔洛韋、膦甲酸、甘露醇、氯噻嗪、聚乙二醇400、依那普利拉 |
|
零滲透性 |
FITC-右旋糖酐、聚乙二醇4000、熒光黃、菊粉、乳果糖 |
|
外排底物 |
***、紫杉醇、奎尼丁、長春堿 |
測定相關(guān)考慮
試驗中應(yīng)證明試驗化合物為被動轉(zhuǎn)運，可以使用表達已知外排轉(zhuǎn)運體的適當測定系統(tǒng)來驗證。對于所選藥物濃度，基底側(cè)至頂端和頂端側(cè)至基底側(cè)方向的表觀滲透性（Papp）比值<2證明是被動轉(zhuǎn)運。
試驗中還需證明滲透性驗證中使用的試驗藥物濃度的合理性。在試驗所處供試液中加入中滲透性和高滲透性藥物作為內(nèi)標，以證明方法的適用性和準確性。此外，應(yīng)在試驗結(jié)束時評價藥物和內(nèi)標的平均回收率，回收率需≥80%。若試驗藥物滲透性數(shù)值≥所選高滲透性內(nèi)標，則認為該試驗藥物具有高滲透性。
4.
案例分享
Caco-2細胞培養(yǎng)
取出凍存的Caco-2細胞，迅速放入37℃水浴中，輕微震蕩使凍存細胞融化。將凍存管中細胞液轉(zhuǎn)至含已預(yù)熱完全培養(yǎng)液的離心管，1000rpm離心5 min，移去上清液，加入5～6mL完全培養(yǎng)液，吹打分散細胞，轉(zhuǎn)至細胞瓶中，用Caco-2細胞完全培養(yǎng)基，37℃ 5% CO
2條件下培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞后，加入適量細胞消化液消化細胞，待細胞從培養(yǎng)瓶底稍微脫落時轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm離心5min，離心后移去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基，細胞計數(shù)后，調(diào)整細胞密度為2×10
5個，于transwell濾膜的頂側(cè)（AP）加入細胞懸液200μL，基底側(cè)（BL）加入無細胞培養(yǎng)基1mL，37℃ 5% CO
2條件下培養(yǎng)。每隔約24～48h換液一次，換液時觀察細胞生長情況，細胞培養(yǎng)后定期進行電阻測量。
圖2 Caco-2細胞模型
滲透性試驗設(shè)計
滲透性實驗分為試驗組（A）和被動轉(zhuǎn)運考察組（B），每組均設(shè)3個復(fù)孔（另設(shè)一空白孔用于電阻值計算），受試物溶液中加入低（納多洛爾）、中（阿替洛爾）、高（普萘洛爾）滲透性藥物作為內(nèi)標。
滲透試驗質(zhì)量控制試驗
待形成致密單層細胞時，用電阻儀測定細胞跨膜電阻值，計算單層細胞膜的跨膜表觀電阻值，當TEER > 200 Ω·cm
2時表明試驗前測試系統(tǒng)合格。試驗結(jié)束后吸去板內(nèi)緩沖液，AP端加入零滲透性內(nèi)標（螢光黃）共孵育，測試系統(tǒng)是否合格。
結(jié)果分析
建立藥物與Caco-2細胞孵育體系，各培養(yǎng)天數(shù)TEER值結(jié)果見圖4，滲透試驗前質(zhì)量控制試驗中TEER值均大于200Ω·cm
2，表明用于本試驗的Caco-2細胞單層細胞膜完整性好。內(nèi)標對照藥的表觀滲透系數(shù)、回收率結(jié)果見表2，低滲透性化合物-納多洛爾、中滲透性化合物-阿替洛爾和高滲透性化合物-普萘洛爾的表觀滲透系數(shù)、回收率及滲透試驗后質(zhì)量控制試驗結(jié)果均符合接受標準，表明測試系統(tǒng)正常工作，建立的Caco-2細胞孵育體系合格，可用于受試藥的Caco-2細胞滲透性試驗探索研究。
圖3 各培養(yǎng)天數(shù)-TEER值折線圖
表2 內(nèi)標藥物表觀滲透系數(shù)和回收率
|
內(nèi)標對照藥 |
表觀滲透系數(shù)
PappAP-BL (10-6cm/s) |
回收率（%） |
|
普萘洛爾 |
23 |
93 |
|
阿替洛爾 |
2.5 |
100 |
|
納多洛爾 |
0.68 |
97 |
|
熒光黃 |
0.00 |
/ |
注：1.當測試物的P
appAP-BL >10.0×10
-6 cm/s 時為高滲透性化合物；1.00×10
-6 cm/s< P
appAP-BL≤ 10.0×10
-6 cm/s時為中滲透性化合物；P
appAP-BL≤1.00×10
-6 cm/s時為低滲透性化合物；2.內(nèi)標對照藥的回收率應(yīng)≥80%。
5.
結(jié)語
Caco-2細胞模型具有相對簡單、重復(fù)性較好、應(yīng)用范圍較廣的特點。通過構(gòu)建致密性良好的Caco-2單層細胞模型，可以分析比較不同藥物的Papp值，從而評估藥物屬于高、中、低滲透性或零滲透性。根據(jù)BCS分類，某些高滲透性藥物可能被豁免進行生物等效性試驗，從而簡化新藥開發(fā)過程。萊恩醫(yī)藥建立了穩(wěn)定、經(jīng)驗證的Caco-2細胞模型，已助力多個客戶完成基于BCS分類系統(tǒng)的生物等效性豁免中的滲透性評價。
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