1 背景介紹
特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種自身免疫相關(guān)的慢性瘙癢炎癥性皮膚病，可伴隨疼痛、紅斑狀丘疹、干皮癥、濕疹等癥狀和臨床表現(xiàn)。AD在成人中發(fā)病率為10%，而在發(fā)達(dá)地區(qū)兒童的患病率更是高達(dá)20%；而半數(shù)以上的患者最終會發(fā)展為其他特應(yīng)性疾病，如哮喘、過敏性鼻炎等。目前AD尚無治愈手段，臨床以外用藥為主，包括糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑、抗組胺藥等治療用藥，以及抗生素、抗菌藥等對癥抗感染用藥；近年來，Janus激酶抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑-4抑制劑、生物制品表現(xiàn)出較好的潛力。理想的動物模型是AD病理機制研究和藥物藥效評價的良好載體。常用的AD動物模型有轉(zhuǎn)基因小鼠模型（如白介素4轉(zhuǎn)基因小鼠）、自發(fā)小鼠模型（如Nc/Nga小鼠）、半抗原（卵清蛋白、2,4-二硝基脲苯、2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)等）誘發(fā)的小鼠模型。Brown-Norway（BN）大鼠為近交系大鼠，具有較高的致敏性，近年來常被用于過敏、哮喘等免疫性疾病研究。應(yīng)用大鼠模型考察經(jīng)皮制劑的抗皮炎藥效作用，在給藥準(zhǔn)確性、操作方面優(yōu)于小鼠模型。本研究以BN大鼠為研究對象，建立DNCB誘發(fā)的AD模型，對模型的表觀指征、因子和病理改變等進(jìn)行檢測，并采用他克莫司軟膏考察模型的適用性，為AD治療藥物開發(fā)提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1 實驗動物
SPF級BN大鼠共20只，雌性，8~10周齡，體重130~160 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
2.2 主要試劑和儀器
（1）主要試劑：0.1%他克莫司軟膏(Astellas Pharma Inc. ,批號057040)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,西亞化學(xué)科技(山東)有限公司,批號WJ6J6)；丙酮(廣州化學(xué)試劑廠，批號2021020109；橄欖油(佳格投資(中國)有限公司，批號2021BZ20191212);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號21022101)；IgEELISA 試劑盒( Reagent Genie Ireland Ltd. , 批號R1074G064)；肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號0607A21)。
（2）主要儀器：電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司)；螺旋測微儀(三豐精密量儀(上海)有限公司)；VMR 型麻醉機(Midmark Corporation)；酶標(biāo)分析儀(BioTek Instruments, Inc. )；生物顯微鏡( LeicaBiosystems)。
2.3 試驗方法
（1）分組與造模：將BN大鼠按體重隨機分為3組，分別為對照組、模型組、他克莫司組。對照組4例動物，模型組和他克莫司組8例動物。分組當(dāng)天記為D0。模型組和他克莫司組動物于D1、D3、D7、D9、D12、D14、D16、D19、D21、D23和D25，雙耳均勻涂抹0.5%DNCB溶液(丙酮∶橄欖油=3∶1) 40μL；對照組動物雙耳均勻涂抹丙酮-橄欖油溶劑40μL，造模期間大鼠佩戴伊麗莎白圈。
（2）給藥：首次造模當(dāng)天開始，對他克莫司組動物右耳經(jīng)皮涂抹他克莫司軟膏每耳30 mg，每天1次，連續(xù)給藥25 d。給藥6 h后以生理鹽水輕輕拭擦除去藥物。每天給藥后至除藥前，大鼠佩戴伊麗莎白圈。對照組和模型組大鼠雙耳、他克莫司組左耳不做處理。
（3）耳部炎癥癥狀評分：每次造模約6 h后，對造模耳進(jìn)行炎癥癥狀評分。評分由干燥/脫屑，出血/紅疹，潰爛/表皮脫落，水腫癥狀綜合評定。每個癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)如下：無癥狀計0分，輕度（癥狀存在，需仔細(xì)辨別觀察方可看到）計1分，中度（癥狀可立即看到）計2分，重度（癥狀非常明顯）計3分。最終評分為4種癥狀評分之和，總分值為0~12分。
（4）耳厚度、耳重量測量：首次造模前、每次造模約6 h后，測量耳厚度；末次造模次日，對動物實施異氟烷吸入麻醉后腹主動脈放血安樂死，裁取對照組雙耳、模型組和他克莫司組右耳近似部位約8 mm大小的圓片，進(jìn)行稱重。
（5）耳組織病理學(xué)檢查：取部分耳圓片組織置于10%福爾馬林中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，常規(guī)蘇木素-伊紅染色和甲苯胺藍(lán)染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚組織增厚、基底細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤等病理改變。病理改變程度根據(jù)下述級別進(jìn)行判定：
|
評價程度 |
視野情況 |
|
正常 |
未觀察到組織學(xué)改變或組織結(jié)構(gòu)基本正常 |
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輕微 |
病理損傷范圍零星可見，不構(gòu)成區(qū)域性 |
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輕度 |
灶性、多灶性或散在分布的損傷，這些損傷范圍在100倍鏡下可見1/3~1個視野 |
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中度 |
損傷在組織中占主導(dǎo)性地位，灶性、多灶性或散在分布的損傷，這些損傷范圍在100倍鏡下可見1~3個視野 |
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重度 |
損傷在組織中占絕對優(yōu)勢，灶性、多灶性或散在分布的損傷，這些損傷范圍在100倍鏡下可見3個視野以上 |
3 試驗結(jié)果
3.1 大鼠耳部炎癥癥狀觀察和評分
造模12 d后，模型組大鼠右耳和左耳耳部皮膚出現(xiàn)紅腫、脫屑、出血等炎癥癥狀，癥狀評分值顯著提高，16 d分值達(dá)到最高，直至25 d均維持在高水平，見圖1。給藥12 ~25 d，與模型組相比，他克莫司組大鼠給藥右耳耳部炎癥癥狀評分值顯著降低，非給藥左耳耳部炎癥癥狀評分值亦明顯降低。
圖1 DNCB誘導(dǎo)大鼠耳組織炎癥反應(yīng)評分（
n=8）
注：A：造模第25天耳部圖；B：大鼠右耳組織炎癥評分；C：大鼠左耳組織炎癥評分。
3.2 大鼠耳厚度和耳重量變化
與對照組相比，造模1 d開始，模型組動物左耳和右耳逐漸增厚；造模9 ~25 d，模型組大鼠左耳和右耳呈顯著性增厚，見圖2。給藥9~25 d，他克莫司組大鼠給藥右耳增厚程度明顯低于模型組右耳，非給藥左耳增厚程度呈現(xiàn)低于模型組左耳的作用及趨勢。
與對照組相比，模型組大鼠左耳和右耳片重量均明顯增加；與模型組相比，他克莫司組大鼠給藥右耳重量顯著減小，非給藥左耳重量亦顯著減小，見表1。
圖2 DNCB誘導(dǎo)大鼠耳組織增厚（
n=8）
注：A：大鼠右耳組織增厚圖；B：大鼠左耳組織增厚圖。
表1 大鼠耳重量變化（
n=8）
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組別 |
給藥右耳重量（g） |
非給藥左耳重量（g） |
|
對照組 |
0.0275±0.0027 |
/ |
|
模型組 |
0.0350±0.0063* |
0.0336±0.0058* |
|
他克莫司組 |
0.0261±0.0018## |
0.0276±0.0034# |
3.3 大鼠耳部組織病理學(xué)改變
組織病理學(xué)結(jié)果見圖3和表2。對照組耳部皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰完整，表皮無增厚，真皮層散在性個別肥大細(xì)胞（箭頭指示）；模型組右耳組織皮膚角化過度和/或不全、顆粒層增厚、基底細(xì)胞變性壞死、細(xì)胞內(nèi)水腫，伴隨真皮層大量的炎細(xì)胞浸潤，肥大細(xì)胞明顯浸潤；他克莫司組右耳皮膚各層結(jié)構(gòu)完整，表皮無增厚，真皮層散在性個別肥大細(xì)胞。
表2 大鼠耳部皮膚病理學(xué)改變（
n=8）
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組別 |
病變
程度 |
表皮增厚 |
基底細(xì)胞變性壞死 |
炎細(xì)胞浸潤 |
肥大細(xì)胞浸潤 |
|
對照組 |
- |
8 |
8 |
8 |
0 |
|
± |
0 |
0 |
0 |
8 |
|
+ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
++ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
+++ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
模型組 |
- |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
± |
0 |
0 |
0 |
1 |
|
+ |
4 |
1 |
2 |
7 |
|
++ |
4 |
7 |
6 |
0 |
|
+++ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
他克莫司組 |
- |
8 |
8 |
8 |
0 |
|
± |
0 |
0 |
0 |
8 |
|
+ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
++ |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
+++ |
0 |
0 |
0 |
0 |
注：-、±、+、++、+++分別表示正常、輕微、輕度、中度和重度。
4 試驗結(jié)論與討論
本研究在造模期間，通過對皮膚炎癥癥狀進(jìn)行評分，并且測量耳部相近部位的厚度，綜合評估模型的發(fā)展；于末期時，通過耳腫脹和組織病理學(xué)檢查，評估模型的病變程度。模型組大鼠耳部皮膚自造模12d起出現(xiàn)明顯的干燥、脫屑、紅疹、潰爛、水腫等炎性反應(yīng)，造模16d時，炎性反應(yīng)達(dá)到峰值。模型組大鼠造模耳于造模后9d起明顯增厚，于造模后16d厚度達(dá)到最大。模型組大鼠耳組織炎性反應(yīng)和耳厚度在造模16~25d均維持在高水平。末期，模型組耳腫脹明顯，耳部組織皮膚出現(xiàn)表皮增厚、基底細(xì)胞變性壞死、細(xì)胞內(nèi)水腫，伴隨真皮層大量的炎細(xì)胞浸潤等AD樣病理學(xué)改變。最終結(jié)果顯示DNCB能誘導(dǎo)BN大鼠出現(xiàn)AD樣反應(yīng)。他克莫司軟膏臨床應(yīng)用于成人及兒童AD，均有較明顯的療效，本研究采用陽性藥他克莫司軟膏評估所建立的AD模型的穩(wěn)定性，可用于藥效學(xué)評價研究，尤其是經(jīng)皮給藥制劑。
本模型在建模和藥物評價中具有以下優(yōu)勢：改善動物的整體情況，能減少動物出現(xiàn)非造模直接因素，如墊料粉塵導(dǎo)致的皮膚損傷感染，降低動物的疼痛級別，滿足3R原則中的“優(yōu)化”原則；采用大鼠模型考察經(jīng)皮給藥制劑藥效作用時，直接對造模耳給藥，不僅避免毛發(fā)的干擾，而且給藥后短時間內(nèi)能使用伊麗莎白圈輔助防止大鼠抓撓給藥部位，均能保證給藥劑量的相對準(zhǔn)確性。
注：DNCB為常用的化學(xué)半抗原性致敏原，常被用于制備免疫性模型。對于AD模型，眾多研究采用的是經(jīng)小鼠背部涂抹DNCB致敏后再于耳部涂抹DNCB激發(fā)，經(jīng)皮給藥部位為致敏背部，實際操作中會存在以下問題：（1）毛發(fā)是小動物皮膚疾病模型建立和炎癥評分的障礙，尤其對于慢性皮膚疾病模型，目前的脫毛劑如脫毛膏、硫化鈉溶液等脫毛效果不佳且維持時間短；（2）背部皮膚致敏導(dǎo)致破損后，容易受到飼養(yǎng)微環(huán)境的影響，需考慮采用玉米芯等少塵少屑的墊料，盡量減少環(huán)境對皮膚炎癥反應(yīng)的影響；（3）皮膚疾病藥物多采用局部給藥途徑，毛發(fā)影響了藥量準(zhǔn)確性?；谏鲜鰡栴}，本研究以DNCB為誘導(dǎo)劑，考察對BN大鼠耳部涂抹刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚AD樣反應(yīng)的可行性。
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