1背景介紹
哮喘又名支氣管哮喘，是一種由復(fù)雜細(xì)胞組分及因子共同參與的常見多發(fā)性疾病。哮喘的特征是氣道的慢性變應(yīng)性炎癥，其主要特征是氣道發(fā)炎，呼吸系統(tǒng)阻力增加等，在其發(fā)病因素中最重要的外因是變應(yīng)原，塵螨是引起哮喘發(fā)病的主要變應(yīng)原之一，因此復(fù)制塵螨模型在哮喘的研究中非常重要。目前國內(nèi)多采用屋塵螨提取液，其成分較為復(fù)雜，很難復(fù)制出天然的塵螨致過敏性哮喘模型，因此本研究采用ALK公司的屋塵螨變應(yīng)原制劑對動物進(jìn)行多次腹腔注射致敏以及霧化激發(fā)進(jìn)行造模，該屋塵螨變應(yīng)原制劑是大分子量蛋白的混合物，吸附在氫氧化鋁上，從而達(dá)到緩慢釋放，長久刺激動物的呼吸系統(tǒng)。本研究以幼齡SD大鼠為研究對象，建立屋塵螨誘發(fā)的幼齡大鼠哮喘模型，對模型的肺功能和病理改變等主要指標(biāo)進(jìn)行檢測，并采用硫酸特布他林片考察模型的適用性，為哮喘治療藥物開發(fā)提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1實(shí)驗(yàn)動物
48只SPF級SD大鼠，3周齡，雌雄各半，體質(zhì)量50~80 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。
2.2主要試劑和儀器
（1）主要試劑：屋塵螨變應(yīng)原制劑；IgE、His ELISA試劑盒。
（2）主要儀器：超聲霧化器；酶標(biāo)分析儀；振蕩式肺功能檢測系統(tǒng)；生物顯微鏡。
2.3試驗(yàn)方法
（1）分組：將幼齡大鼠按照體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為陰性對照組、模型對照組、陽性對照組（予硫酸特布他林片），每組8只動物，雌雄各半。
（2）造模：陰性對照組以PBS溶液致敏和激發(fā)，其余各組大鼠均于分組后腹腔注射屋塵螨變應(yīng)原制劑（1000 SQ-U/mL,0.1 mL/只），每天注射1次，連續(xù)3 d，末次致敏后間隔14 d進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)方法：動物置于霧化裝置中，每天不間斷霧化吸入屋塵螨變應(yīng)原制劑（2000 SQ-U/mL)5 min，連續(xù)霧化激發(fā)7 d。
（3）給藥：按體表面積等效劑量法折算，設(shè)定陽性對照組（硫酸特布他林片）的給藥劑量為0.72 mg/kg，前4 d給予等體積的純水，后3d給予硫酸特布他林藥液。
（4）檢測指標(biāo)：①各組大鼠均于末次激發(fā)后，采用1.5%戊巴比妥鈉注射液尾靜脈注射麻醉，然后行頸部正中氣管切開并插管，測定
呼吸系統(tǒng)阻力（Rrs）、呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性（Crs）及呼吸系統(tǒng)彈性（Ers）。②測定結(jié)束后采用腹主動脈采血法將動物安樂死，取全血測定
白細(xì)胞總數(shù)。③剩余血液不抗凝，分離血清，用于
IgE、His表達(dá)水平的測定。④剖取動物肺臟稱取質(zhì)量計(jì)算
肺臟系數(shù)。⑤將各組動物肺臟組織用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察各組動物的
肺臟組織病理學(xué)變化。
3試驗(yàn)結(jié)果
3.1 肺功能
與陰性對照組相比，模型對照組動物Rrs、Ers均顯著升高，Crs顯著降低；與模型對照組相比，陽性對照組動物Rrs、Ers均顯著降低，Crs顯著升高。見表1。
表1 大鼠肺功能指標(biāo)檢測結(jié)果
|
組別 |
n |
Rrs(cmH2O·s/mL) |
Crs (mL/cmH2O) |
Ers (cmH2O/mL) |
|
陰性對照組 |
8 |
0.1126±0.0020 |
0.7715±0.0269 |
1.3790±0.0506 |
|
模型對照組 |
8 |
0.1363±0.00524△ |
0.5554±0.03094△△△ |
1.7912±0.0778 △△△ |
|
陽性對照組 |
8 |
0.1104±0.0022 ∗ |
0.6927±0.0221 ∗ |
1.5026±0.0325∗∗ |
注：與陰性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型對照組比較，∗P<0.05，∗∗P<0.01，下同。
3.2 肺臟系數(shù)
與陰性對照組相比，模型對照組動物肺臟系數(shù)顯著升高。與模型對照組相比，陽性對照組動物肺臟系數(shù)顯著降低，見表2。
表2 大鼠肺臟系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
|
組別 |
n |
體質(zhì)量(g) |
肺臟質(zhì)量（g) |
肺臟系數(shù)（%） |
|
陰性對照組 |
8 |
287.00±22.00 |
1.39±0.08 |
0.48±0.01 |
|
模型對照組 |
8 |
286.00±21.00 |
1.57±0.09 |
0.55±0.02△ |
|
陽性對照組 |
8 |
304.00±23.00 |
1.44±0.08 |
0.48±0.02∗ |
3.3 白細(xì)胞總數(shù)
與陰性對照組相比，模型對照組動物白細(xì)胞總數(shù)顯著增多。與模型對照組相比，陽性對照組動物白細(xì)胞總數(shù)未見明顯差異，見表3。
表3 大鼠血液中白細(xì)胞總數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
|
組別 |
n |
白細(xì)胞總數(shù) (×10^9/L) |
|
陰性對照組 |
8 |
2.80±0.34 |
|
模型對照組 |
8 |
6.22±0.5544 |
|
陽性對照組 |
8 |
5.15±0.79 |
3.4 血清lgE及His表達(dá)水平
與陰性對照組相比，模型對照組動物血清中IgE、His表達(dá)水平均顯著升高。與模型對照組相比，陽性對照組IgE、His表達(dá)水平均無顯著差異，見表4。
表4 大鼠血清中IgE及His表達(dá)水平
|
組別 |
n |
IgE(μg/mL) |
His(ng/mL) |
|
陰性對照組 |
8 |
22.02±0.85 |
11.67±0.16 |
|
模型對照組 |
8 |
25.02±0.4944△△ |
12.54±0.2244△△ |
|
陽性對照組 |
8 |
23.93±0.68 |
12.12±0.22 |
3.5 各組大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果
陰性對照組動物肺臟各級管腔結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔無擴(kuò)張或縮小，間質(zhì)支氣管/血管無疏松或狹窄，亦未見炎細(xì)胞浸潤，見圖1。模型對照組動物肺臟氣道壁皺縮、血管周圍疏松/水腫、支氣管/血管間質(zhì)炎細(xì)胞（以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主）浸潤，而陽性對照組動物上述病變均有不同程度的減輕。
圖1 大鼠肺臟組織病理學(xué)變化（HE染色，100×）
4試驗(yàn)結(jié)論與討論
本研究采用吸附于氫氧化鋁上的屋塵螨變應(yīng)原制劑對4周齡大鼠進(jìn)行腹腔注射致敏，間隔2周后進(jìn)行霧化激發(fā)，該誘喘劑致敏、激發(fā)后在幼齡動物體內(nèi)緩慢釋放，不斷刺激動物發(fā)育階段的呼吸系統(tǒng)，較好地模擬出臨床上兒童因長期處于粉塵環(huán)境中而導(dǎo)致的過敏性哮喘疾病。本試驗(yàn)結(jié)合哮喘的發(fā)病機(jī)制，采用屋塵螨對動物進(jìn)行致敏和激發(fā)造模。模型建立成功后主要從肺功能、免疫應(yīng)答、炎癥、肺水腫、肺組織病理學(xué)等幾個方面考察硫酸特布他林片對幼齡動物哮喘的改善作用。首先采用振蕩式肺功能檢測系統(tǒng)測定大鼠的肺功能指標(biāo)，結(jié)果顯示模型對照組動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性均顯著升高，順應(yīng)性顯著降低，表明模型動物已具有明顯的呼吸功能障礙。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型對照組動物表現(xiàn)出明顯的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫。推斷上述病理變化為導(dǎo)致模型動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性升高、順應(yīng)性下降的主觀因素，而硫酸特布他林片在0.72 mg/kg劑量下對動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性的降低均有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，進(jìn)而導(dǎo)致動物的順應(yīng)性升高。綜合病理學(xué)結(jié)果表明，硫酸特布他林片可以很好地緩解幼齡哮喘動物的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫，改善幼齡哮喘動物的呼吸功能。本研究采用陽性藥硫酸特布他林片評估所建立的哮喘動物模型的穩(wěn)定性，可用于藥效學(xué)評價研究。
.png)
