1 背景介紹
肥胖和哮喘的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)顯著上升，兩者之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。肥胖不僅是一種獨(dú)立的代謝性疾病，而且被認(rèn)為是哮喘的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，肥胖性哮喘患者往往表現(xiàn)為更嚴(yán)重的氣道炎癥和氣道重構(gòu)。肥胖狀態(tài)下的慢性低度炎癥也可加劇哮喘的病程，影響其治療效果。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肥胖型哮喘更容易導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作，且即使給予一線抗哮喘藥物治療，肥胖型哮喘患者的病情依然控制不佳。因此，建立一個(gè)能夠模擬肥胖與哮喘相互作用的動(dòng)物模型對(duì)于深入理解這兩種疾病的病理機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。C57BL/6小鼠作為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因其遺傳背景清晰、常被用于肥胖和哮喘的研究。高脂飼料喂養(yǎng)是一種有效的飲食誘導(dǎo)肥胖（DIO）模型建立方法，能夠模擬人類(lèi)由于不健康飲食習(xí)慣導(dǎo)致的肥胖狀態(tài)。而OVA作為一種常見(jiàn)的過(guò)敏原，已被廣泛用于誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過(guò)敏性哮喘。本研究旨在通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合OVA誘導(dǎo)的方法，在C57BL/6小鼠中建立肥胖哮喘慢性炎癥模型。在模型建立后，對(duì)模型的肺功能和病理改變等主要指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并采用硫酸特布他林片考察模型的適用性，為哮喘治療藥物開(kāi)發(fā)提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康C57BL/6小鼠102只，雌雄各半，體重(8.5~14.8)ｇ，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司
2.2主要試劑和儀器
（1）主要試劑：硫酸特布他林片；OVA；高脂飼料
（2）主要儀器：超聲霧化器；酶標(biāo)分析儀；振蕩式肺功能檢測(cè)系統(tǒng)；生物顯微鏡
2.3試驗(yàn)方法
（1）分組：在動(dòng)物適應(yīng)性觀察結(jié)束之后，隨機(jī)挑選8只為陰性對(duì)照組(Control)，正常維持飼料喂養(yǎng)；其他動(dòng)物高脂飼料喂養(yǎng)。六周后分組，選取體重大于陰性對(duì)照組平均體重約20%的動(dòng)物建立肥胖哮喘模型，分為肥胖組(Obesity model)、肥胖哮喘模型組(Obesity asthma model)、硫酸特布他林(Terbutaline)組。
（2）造模：肥胖哮喘模型組和硫酸特布他林組通過(guò)腹腔注射10 mg·L
-1 OVA溶液 0.2 mL進(jìn)行致敏，隔天1次，連續(xù)3次，觀察14 d后激發(fā)，激發(fā)時(shí)將OVA溶液10 mg·L
-1霧化吸入，每天1次，每次3～5 min，連續(xù)7 d。陰性對(duì)照組和肥胖組以等量PBS溶液致敏和激發(fā)。
（3）給藥：采用灌胃給藥，于致敏d 1開(kāi)始持續(xù)至動(dòng)物處理，給藥體積30 mL·kg
-1，每天1次，共26 d，陰性對(duì)照組和模型組給予等體積的純水；硫酸特布他林組于后5 d灌胃給藥，前21 d給予等體積的純水。
（4）檢測(cè)指標(biāo)：①各組小鼠均于末次激發(fā)后，采用1%戊巴比妥鈉注射液尾靜脈注射麻醉，然后行頸部正中氣管切開(kāi)并插管，測(cè)定呼吸系統(tǒng)阻力（Rrs）、呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性（Crs）及呼吸系統(tǒng)彈性（Ers）。②測(cè)定結(jié)束后采用腹主動(dòng)脈采血法將動(dòng)物安樂(lè)死，取全血測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)。③剩余血液不抗凝，分離血清，用于IgE表達(dá)水平的測(cè)定。④剖取動(dòng)物肺臟稱(chēng)取質(zhì)量計(jì)算肺臟系數(shù)。⑤將各組動(dòng)物肺臟組織用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片，HE和Masson染色后，光鏡下觀察各組動(dòng)物的肺臟組織病理學(xué)變化。部分石蠟切片用于免疫組化檢測(cè)小鼠肺組織中Smad3及SARA蛋白表達(dá)。取動(dòng)物部分肺組織-80 ℃冷凍保存，4周內(nèi)取出勻漿，吸取上清，采用ELISA法檢測(cè)TGF-β1、Smad3、SP含量。
3試驗(yàn)結(jié)果
3.1 肥胖哮喘小鼠體重和肺臟指數(shù)的變化
與陰性對(duì)照組相比，給藥期間各組動(dòng)物體質(zhì)量均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖 1。與陰性對(duì)照組相比，各組動(dòng)物肺臟質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，肺臟系數(shù)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。
圖1小鼠體重變化結(jié)果
表1 小鼠肺臟系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 #P<0.05 vs Control
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Group |
Weight/g |
Lung weight/g |
Lung coefficient/% |
|
Control |
25.5±2.7 |
0.149±0.013 |
0.590±0.059 |
|
Obesity model |
32.4±4.2# |
0.158±0.010 |
0.494±0.063 |
|
Obesity asthma model |
30.0±3.7# |
0.180±0.017 |
0.607±0.075 |
|
Terbutaline |
31.1±3.9# |
0.172±0.021 |
0.564±0.121 |
3.2 肥胖哮喘小鼠呼吸功能指標(biāo)變化
與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組動(dòng)物Rrs、Ers均顯著升高(P<0.05)，Crs顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物Rrs(P<0.05)、Ers均顯著降低，Crs顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 小鼠呼吸功能指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
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Group |
Rrs (cmH2O.s/ mL) |
Ers (cmH2O/ mL) |
Crs (mL/ cm H2O) |
|
Control |
0.8888±0.048 6 |
29.0206±4.657 1 |
0.034 5±0.006 1 |
|
Obesity model |
0.9829±0.098 9 |
33.5780±3.726 2 |
0.033 1±0.003 5 |
|
Obesity asthma model |
1.216 5±0.294 9# |
37.3646±13.583 6# |
0.026 8±0.006 5 |
|
Terbutaline |
0.877 4±0.142 6* |
27.196 0±6.606 5 |
0.035 8±0.013 2* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.3 肥胖哮喘小鼠組織病理學(xué)變化
HE染色結(jié)果顯示，肥胖哮喘模型組小鼠肺臟出現(xiàn)不同程度細(xì)支氣管黏膜增高(P<0.05)，主要表現(xiàn)為細(xì)支氣管管腔變小，黏膜擠壓增高，陽(yáng)性藥物治療后，細(xì)支氣管黏膜增高明顯緩解(P<0.05)。MASSON 染色結(jié)果可見(jiàn)肥胖哮喘模型組膠原蛋白沉積面積較陰性對(duì)照組明顯增加，陽(yáng)性藥物對(duì)OVA誘導(dǎo)的膠原沉積有明顯的抑制作用。見(jiàn)圖2，圖3及表3。
圖2 小鼠肺臟HE染色結(jié)果（×200）
圖3 小鼠肺臟MASSON染色結(jié)果（×200）.png)
表3 小鼠支氣管黏膜厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果
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Group |
Bronchial mucosal thickness/μm |
|
Control |
18.17±1.54 |
|
Obesity model |
20.22±2.23 |
|
Obesity asthma model |
32.26±3.58# |
|
Terbutaline |
21.17±1.87* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.4 肥胖哮喘小鼠的炎癥變化
與陰性對(duì)照組比較，肥胖哮喘模型組白細(xì)胞總數(shù)升高，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)，陽(yáng)性藥物治療后抑制了血液中白細(xì)胞種類(lèi)的增加。與陰性對(duì)照組比較，肥胖哮喘模型組血清中IgE含量、肺組織中SP含量明顯升高(P<0.05)，在陽(yáng)性藥物治療后抑制了IgE 和SP 的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表 4,5。
表4 小鼠血清中白細(xì)胞總數(shù)和IgE水平
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Group |
Total white blood cells (×109·L-1) |
IgE/mg·L-1 |
|
Control |
2.429±0.690 |
8.709±0.468 |
|
Obesity model |
1.804±0.443 |
9.213±0.455 |
|
Obesity asthma model |
3.081±1.324 |
9.341±0.746# |
|
Terbutaline |
2.261±0.640 |
8.053±0.570#* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
表5 小鼠血清中SP水平 #P<0.05 vs Control
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Group |
SP/ng.L-1 |
|
Control |
468.388±38.477 |
|
Obesity model |
515.068±32.569 |
|
Obesity asthma model |
567.704±48.575# |
|
Terbutaline |
484.934±33.458* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.5 肥胖哮喘小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的變化
ELISA結(jié)果表明，肥胖哮喘模型組與陰性對(duì)照組比較TGF-β1水平明顯升高(P<0.05)；同時(shí)，Smad3的磷酸化水平在肥胖哮喘模型組明顯升高(P<0.05)，而升高的磷酸化水平，可以被陽(yáng)性藥物抑制。IHC結(jié)果表明，Smad3及SARA蛋白水平在模型組表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，經(jīng)陽(yáng)性藥治療后Smad3及TGF-β1在肺組織表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖4,5。
表6 小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達(dá)水平
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Group |
TGF-β1/μg·L-1 |
Smad3/μg·L-1 |
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Control |
166.083±13.232 |
97.479±8.348 |
|
Obesity model |
177.197±10.886 |
105.741±5.105 |
|
Obesity asthma model |
185.179±18.410# |
115.344±4.814# |
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Terbutaline |
163.683±5.438* |
94.711±6.395* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
圖4 肺組織中Smad3的表達(dá)（×200）
圖5 肺組織中SARA的表達(dá)（×200）
4試驗(yàn)結(jié)論與討論
研究采用高脂飼料聯(lián)合OVA致敏激發(fā)的方法，成功建立了一種模擬肥胖和哮喘特征性病理變化的C57BL/6小鼠模型。該模型在體重增長(zhǎng)、肺臟指數(shù)、呼吸功能異常以及肺組織病理學(xué)改變等方面，與肥胖型哮喘患者的臨床表現(xiàn)高度一致。此外，肺組織病理學(xué)檢查揭示了模型組小鼠的細(xì)支氣管黏膜的增生和膠原蛋白的沉積，表現(xiàn)為細(xì)支氣管管腔縮小和黏膜擠壓增高。模型組小鼠血清中的IgE和SP含量升高，指示了體內(nèi)過(guò)敏反應(yīng)和炎癥過(guò)程的激活。免疫組化檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了哮喘相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的顯著增加，這與模型的病理學(xué)特征相一致。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種肥胖哮喘模型，其病理學(xué)和生理學(xué)特征與肥胖型哮喘患者高度相似，且該模型對(duì)硫酸特布他林的反應(yīng)顯著，相比模型組癥狀得到顯著的改善，表明了該模型對(duì)藥物的反應(yīng)敏感，可為肥胖型哮喘治療藥物的開(kāi)發(fā)和評(píng)估提供了一個(gè)可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
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