前言
含有相同藥物活性成份的兩種制劑，若在相同摩爾劑量給后的生物利用度（藥物吸收速度和吸收程度）落在可接受的預定限度內，則被認為具有生物等效性。生物等效性分類（BCS）是一種根據溶解性和滲透性對藥物進行分類的方法，分為4個類別，即Ⅰ類（高溶解性，高滲透性）、Ⅱ類（低溶解性，高滲透性）、Ⅲ類（高溶解性，低滲透性）、Ⅳ類（低溶解性，低滲透性）。基于BCS的基本理論，藥物活性成分（API）與藥物制劑的溶出特征和輔料組成，二者一同構成控制普通口服制劑API吸收率和吸收程度的主要因素。
1.
基于BCS分類豁免生物等效性的發展
FDA于2000年發布指導原則，允許BCS Ⅰ類API的普通口服固體制劑在特定的溶出特征和輔料組成條件下豁免生物等效性研究，是首個應用BCS的生物等效性豁免的監管機構。NMPA于2016年發布了《人體生物等效性豁免指導原則》，適用于仿制藥質量和療效一致性評價中普通口服制劑基于BCS申請生物等效豁免，并于2018年多次單獨發布可豁免或簡化人體生物等效性試驗品種目錄。2019年ICH指導原則《M9：基于生物藥劑學分類系統的生物等效性豁免》進入Step 4采納階段，目前在實施階段。我國國家藥監局藥審中心于2021年12月發布第61號公告《關于實施國際人用藥品注冊技術協調會指導原則M9及問答有關事項的通知》，標志著我國基于BCS分類系統生物等效性豁免全面執行ICH M9指導原則。
2. Caco-2
細胞在基于BCS分類豁免生物等效性中的應用
Caco-2
細胞模型是一種人克隆
結腸腺癌細胞，其結構和功能類似于分化的小腸
上皮細胞，具有
微絨毛等結構，并含有與小腸
刷狀緣上皮相關的
酶系，可以用來進行模擬體內腸轉運的實驗。ICH M9指導原則指出，評價滲透性應優先基于人體藥代動力學研究得出的吸收程度，例如絕對生物利用度或物質平衡。若絕對生物利用度³85%，則認為具有高滲透性。若³85%的給藥劑量在尿中以原形藥物，或以原形藥物、Ⅰ相氧化和Ⅱ相結合代謝產物的總回收率，也認為具有高滲透性。基于BCS分類豁免生物等效性可接受已發表文獻中的人體數據，但需包含必要的試驗細節，否則無法判斷研究結果的質量。還可使用經驗證和標準化的Caco-2細胞體外方法評價滲透性，但Caco-2細胞測定結果應基于已獲得的人體藥代動力學數據進行評價。若通過體外細胞模型推斷為高滲透性，還需證明滲透性不依賴于主動轉運。
圖1 Transwell培養板建立Caco-2細胞模型
3. Caco-2
細胞滲透性測定方法的相關考慮
方法學驗證
應使用零、低（<50%）、中（50-84%）和高（³85%）滲透模型藥物，建立實驗滲透率與人體藥物吸收程度之間的排序相關性，以證明Caco-2細胞測定方法用于BCS滲透性測定的適用性。應通過在試驗前后比較跨上皮電阻（TEER）測量值和或其他合適指標，確認Caco-2細胞單層的完整性。還應通過已證實的零滲透性化合物證明細胞單層的完整性（參見表1）。
表1 用于滲透性測定方法驗證模型藥物示例
|
分組 |
藥物 |
高滲透性
（fa³85%） |
安替比林、***、酮洛芬、萘普生、茶堿、美托洛爾、普萘洛爾、卡馬西平、苯妥英、丙吡胺、米諾地爾 |
中滲透性
（fa =50-84%） |
氯苯那敏、肌酐、特布他林、氫氯噻嗪、依那普利、呋塞米、二甲雙胍、阿米洛利、阿替洛爾、雷尼替丁 |
中滲透性
（fa <50%） |
法莫替丁、納多洛爾、舒必利、賴諾普利、阿昔洛韋、膦甲酸、甘露醇、氯噻嗪、聚乙二醇400、依那普利拉 |
|
零滲透性 |
FITC-右旋糖酐、聚乙二醇4000、熒光黃、菊粉、乳果糖 |
|
外排底物 |
***、紫杉醇、奎尼丁、長春堿 |
測定相關考慮
試驗中應證明試驗化合物為被動轉運，可以使用表達已知外排轉運體的適當測定系統來驗證。對于所選藥物濃度，基底側至頂端和頂端側至基底側方向的表觀滲透性（Papp）比值<2證明是被動轉運。
試驗中還需證明滲透性驗證中使用的試驗藥物濃度的合理性。在試驗所處供試液中加入中滲透性和高滲透性藥物作為內標，以證明方法的適用性和準確性。此外，應在試驗結束時評價藥物和內標的平均回收率，回收率需≥80%。若試驗藥物滲透性數值≥所選高滲透性內標，則認為該試驗藥物具有高滲透性。
4.
案例分享
Caco-2細胞培養
取出凍存的Caco-2細胞，迅速放入37℃水浴中，輕微震蕩使凍存細胞融化。將凍存管中細胞液轉至含已預熱完全培養液的離心管，1000rpm離心5 min，移去上清液，加入5～6mL完全培養液，吹打分散細胞，轉至細胞瓶中，用Caco-2細胞完全培養基，37℃ 5% CO
2條件下培養。收集處于對數生長期的Caco-2細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞后，加入適量細胞消化液消化細胞，待細胞從培養瓶底稍微脫落時轉移至離心管，1000rpm離心5min，離心后移去上清液，加入適量完全培養基，細胞計數后，調整細胞密度為2×10
5個，于transwell濾膜的頂側（AP）加入細胞懸液200μL，基底側（BL）加入無細胞培養基1mL，37℃ 5% CO
2條件下培養。每隔約24～48h換液一次，換液時觀察細胞生長情況，細胞培養后定期進行電阻測量。
圖2 Caco-2細胞模型
滲透性試驗設計
滲透性實驗分為試驗組（A）和被動轉運考察組（B），每組均設3個復孔（另設一空白孔用于電阻值計算），受試物溶液中加入低（納多洛爾）、中（阿替洛爾）、高（普萘洛爾）滲透性藥物作為內標。
滲透試驗質量控制試驗
待形成致密單層細胞時，用電阻儀測定細胞跨膜電阻值，計算單層細胞膜的跨膜表觀電阻值，當TEER > 200 Ω·cm
2時表明試驗前測試系統合格。試驗結束后吸去板內緩沖液，AP端加入零滲透性內標（螢光黃）共孵育，測試系統是否合格。
結果分析
建立藥物與Caco-2細胞孵育體系，各培養天數TEER值結果見圖4，滲透試驗前質量控制試驗中TEER值均大于200Ω·cm
2，表明用于本試驗的Caco-2細胞單層細胞膜完整性好。內標對照藥的表觀滲透系數、回收率結果見表2，低滲透性化合物-納多洛爾、中滲透性化合物-阿替洛爾和高滲透性化合物-普萘洛爾的表觀滲透系數、回收率及滲透試驗后質量控制試驗結果均符合接受標準，表明測試系統正常工作，建立的Caco-2細胞孵育體系合格，可用于受試藥的Caco-2細胞滲透性試驗探索研究。
圖3 各培養天數-TEER值折線圖
表2 內標藥物表觀滲透系數和回收率
|
內標對照藥 |
表觀滲透系數
PappAP-BL (10-6cm/s) |
回收率（%） |
|
普萘洛爾 |
23 |
93 |
|
阿替洛爾 |
2.5 |
100 |
|
納多洛爾 |
0.68 |
97 |
|
熒光黃 |
0.00 |
/ |
注：1.當測試物的P
appAP-BL >10.0×10
-6 cm/s 時為高滲透性化合物；1.00×10
-6 cm/s< P
appAP-BL≤ 10.0×10
-6 cm/s時為中滲透性化合物；P
appAP-BL≤1.00×10
-6 cm/s時為低滲透性化合物；2.內標對照藥的回收率應≥80%。
5.
結語
Caco-2細胞模型具有相對簡單、重復性較好、應用范圍較廣的特點。通過構建致密性良好的Caco-2單層細胞模型，可以分析比較不同藥物的Papp值，從而評估藥物屬于高、中、低滲透性或零滲透性。根據BCS分類，某些高滲透性藥物可能被豁免進行生物等效性試驗，從而簡化新藥開發過程。萊恩醫藥建立了穩定、經驗證的Caco-2細胞模型，已助力多個客戶完成基于BCS分類系統的生物等效性豁免中的滲透性評價。
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