1 背景介紹
肥胖和哮喘的發病率在全球范圍內顯著上升，兩者之間存在著復雜的相互作用關系。肥胖不僅是一種獨立的代謝性疾病，而且被認為是哮喘的一個重要危險因素，肥胖性哮喘患者往往表現為更嚴重的氣道炎癥和氣道重構。肥胖狀態下的慢性低度炎癥也可加劇哮喘的病程，影響其治療效果。近年來多項研究發現，肥胖型哮喘更容易導致哮喘急性發作，且即使給予一線抗哮喘藥物治療，肥胖型哮喘患者的病情依然控制不佳。因此，建立一個能夠模擬肥胖與哮喘相互作用的動物模型對于深入理解這兩種疾病的病理機制以及開發新的治療策略具有重要意義。C57BL/6小鼠作為常用的實驗動物，因其遺傳背景清晰、常被用于肥胖和哮喘的研究。高脂飼料喂養是一種有效的飲食誘導肥胖（DIO）模型建立方法，能夠模擬人類由于不健康飲食習慣導致的肥胖狀態。而OVA作為一種常見的過敏原，已被廣泛用于誘導小鼠產生過敏性哮喘。本研究旨在通過高脂飼料喂養聯合OVA誘導的方法，在C57BL/6小鼠中建立肥胖哮喘慢性炎癥模型。在模型建立后，對模型的肺功能和病理改變等主要指標進行檢測，并采用硫酸特布他林片考察模型的適用性，為哮喘治療藥物開發提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1實驗動物
健康C57BL/6小鼠102只，雌雄各半，體重(8.5~14.8)ｇ，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司
2.2主要試劑和儀器
（1）主要試劑：硫酸特布他林片；OVA；高脂飼料
（2）主要儀器：超聲霧化器；酶標分析儀；振蕩式肺功能檢測系統；生物顯微鏡
2.3試驗方法
（1）分組：在動物適應性觀察結束之后，隨機挑選8只為陰性對照組(Control)，正常維持飼料喂養；其他動物高脂飼料喂養。六周后分組，選取體重大于陰性對照組平均體重約20%的動物建立肥胖哮喘模型，分為肥胖組(Obesity model)、肥胖哮喘模型組(Obesity asthma model)、硫酸特布他林(Terbutaline)組。
（2）造模：肥胖哮喘模型組和硫酸特布他林組通過腹腔注射10 mg·L
-1 OVA溶液 0.2 mL進行致敏，隔天1次，連續3次，觀察14 d后激發，激發時將OVA溶液10 mg·L
-1霧化吸入，每天1次，每次3～5 min，連續7 d。陰性對照組和肥胖組以等量PBS溶液致敏和激發。
（3）給藥：采用灌胃給藥，于致敏d 1開始持續至動物處理，給藥體積30 mL·kg
-1，每天1次，共26 d，陰性對照組和模型組給予等體積的純水；硫酸特布他林組于后5 d灌胃給藥，前21 d給予等體積的純水。
（4）檢測指標：①各組小鼠均于末次激發后，采用1%戊巴比妥鈉注射液尾靜脈注射麻醉，然后行頸部正中氣管切開并插管，測定呼吸系統阻力（Rrs）、呼吸系統順應性（Crs）及呼吸系統彈性（Ers）。②測定結束后采用腹主動脈采血法將動物安樂死，取全血測定白細胞總數。③剩余血液不抗凝，分離血清，用于IgE表達水平的測定。④剖取動物肺臟稱取質量計算肺臟系數。⑤將各組動物肺臟組織用10%甲醛固定，經脫水、石蠟包埋，切片，HE和Masson染色后，光鏡下觀察各組動物的肺臟組織病理學變化。部分石蠟切片用于免疫組化檢測小鼠肺組織中Smad3及SARA蛋白表達。取動物部分肺組織-80 ℃冷凍保存，4周內取出勻漿，吸取上清，采用ELISA法檢測TGF-β1、Smad3、SP含量。
3試驗結果
3.1 肥胖哮喘小鼠體重和肺臟指數的變化
與陰性對照組相比，給藥期間各組動物體質量均明顯增加(P<0.05)。見圖 1。與陰性對照組相比，各組動物肺臟質量明顯降低(P<0.05)，肺臟系數降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。
圖1小鼠體重變化結果
表1 小鼠肺臟系數統計結果 #P<0.05 vs Control
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Group |
Weight/g |
Lung weight/g |
Lung coefficient/% |
|
Control |
25.5±2.7 |
0.149±0.013 |
0.590±0.059 |
|
Obesity model |
32.4±4.2# |
0.158±0.010 |
0.494±0.063 |
|
Obesity asthma model |
30.0±3.7# |
0.180±0.017 |
0.607±0.075 |
|
Terbutaline |
31.1±3.9# |
0.172±0.021 |
0.564±0.121 |
3.2 肥胖哮喘小鼠呼吸功能指標變化
與陰性對照組相比，模型對照組動物Rrs、Ers均顯著升高(P<0.05)，Crs顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組動物Rrs(P<0.05)、Ers均顯著降低，Crs顯著升高(P<0.05)。見表2。
表2 小鼠呼吸功能指標統計結果
|
Group |
Rrs (cmH2O.s/ mL) |
Ers (cmH2O/ mL) |
Crs (mL/ cm H2O) |
|
Control |
0.8888±0.048 6 |
29.0206±4.657 1 |
0.034 5±0.006 1 |
|
Obesity model |
0.9829±0.098 9 |
33.5780±3.726 2 |
0.033 1±0.003 5 |
|
Obesity asthma model |
1.216 5±0.294 9# |
37.3646±13.583 6# |
0.026 8±0.006 5 |
|
Terbutaline |
0.877 4±0.142 6* |
27.196 0±6.606 5 |
0.035 8±0.013 2* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.3 肥胖哮喘小鼠組織病理學變化
HE染色結果顯示，肥胖哮喘模型組小鼠肺臟出現不同程度細支氣管黏膜增高(P<0.05)，主要表現為細支氣管管腔變小，黏膜擠壓增高，陽性藥物治療后，細支氣管黏膜增高明顯緩解(P<0.05)。MASSON 染色結果可見肥胖哮喘模型組膠原蛋白沉積面積較陰性對照組明顯增加，陽性藥物對OVA誘導的膠原沉積有明顯的抑制作用。見圖2，圖3及表3。
圖2 小鼠肺臟HE染色結果（×200）
圖3 小鼠肺臟MASSON染色結果（×200）.png)
表3 小鼠支氣管黏膜厚度統計結果
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Group |
Bronchial mucosal thickness/μm |
|
Control |
18.17±1.54 |
|
Obesity model |
20.22±2.23 |
|
Obesity asthma model |
32.26±3.58# |
|
Terbutaline |
21.17±1.87* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.4 肥胖哮喘小鼠的炎癥變化
與陰性對照組比較，肥胖哮喘模型組白細胞總數升高，但差異無顯著性(P>0.05)，陽性藥物治療后抑制了血液中白細胞種類的增加。與陰性對照組比較，肥胖哮喘模型組血清中IgE含量、肺組織中SP含量明顯升高(P<0.05)，在陽性藥物治療后抑制了IgE 和SP 的表達(P<0.05)。見表 4,5。
表4 小鼠血清中白細胞總數和IgE水平
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Group |
Total white blood cells (×109·L-1) |
IgE/mg·L-1 |
|
Control |
2.429±0.690 |
8.709±0.468 |
|
Obesity model |
1.804±0.443 |
9.213±0.455 |
|
Obesity asthma model |
3.081±1.324 |
9.341±0.746# |
|
Terbutaline |
2.261±0.640 |
8.053±0.570#* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
表5 小鼠血清中SP水平 #P<0.05 vs Control
|
Group |
SP/ng.L-1 |
|
Control |
468.388±38.477 |
|
Obesity model |
515.068±32.569 |
|
Obesity asthma model |
567.704±48.575# |
|
Terbutaline |
484.934±33.458* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
3.5 肥胖哮喘小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的變化
ELISA結果表明，肥胖哮喘模型組與陰性對照組比較TGF-β1水平明顯升高(P<0.05)；同時，Smad3的磷酸化水平在肥胖哮喘模型組明顯升高(P<0.05)，而升高的磷酸化水平，可以被陽性藥物抑制。IHC結果表明，Smad3及SARA蛋白水平在模型組表達較陰性對照組明顯升高(P<0.05)，經陽性藥治療后Smad3及TGF-β1在肺組織表達水平下調(P<0.05)。見表6，圖4,5。
表6 小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達水平
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Group |
TGF-β1/μg·L-1 |
Smad3/μg·L-1 |
|
Control |
166.083±13.232 |
97.479±8.348 |
|
Obesity model |
177.197±10.886 |
105.741±5.105 |
|
Obesity asthma model |
185.179±18.410# |
115.344±4.814# |
|
Terbutaline |
163.683±5.438* |
94.711±6.395* |
Note：
#P<0.05 vs Control,
*P<0.05 vs Obesity asthma model.
圖4 肺組織中Smad3的表達（×200）
圖5 肺組織中SARA的表達（×200）
4試驗結論與討論
研究采用高脂飼料聯合OVA致敏激發的方法，成功建立了一種模擬肥胖和哮喘特征性病理變化的C57BL/6小鼠模型。該模型在體重增長、肺臟指數、呼吸功能異常以及肺組織病理學改變等方面，與肥胖型哮喘患者的臨床表現高度一致。此外，肺組織病理學檢查揭示了模型組小鼠的細支氣管黏膜的增生和膠原蛋白的沉積，表現為細支氣管管腔縮小和黏膜擠壓增高。模型組小鼠血清中的IgE和SP含量升高，指示了體內過敏反應和炎癥過程的激活。免疫組化檢測結果證實了哮喘相關信號通路蛋白表達水平的顯著增加，這與模型的病理學特征相一致。綜上所述，本研究成功構建了一種肥胖哮喘模型，其病理學和生理學特征與肥胖型哮喘患者高度相似，且該模型對硫酸特布他林的反應顯著，相比模型組癥狀得到顯著的改善，表明了該模型對藥物的反應敏感，可為肥胖型哮喘治療藥物的開發和評估提供了一個可靠的實驗平臺。
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